流式定量微球QSC的应用中可能遇到的问题

QSC微球可以用于定量蛋白等分子在细胞表面的表达，在药物开发、治疗效果评估方面有重要的应用价值，为众多科研人员选择。

鉴于QSC价格较高，很多新人在开始实验前总会不少顾虑，现在整理一下资料，列出一些可能遇到的问题，供参考。

QSC kits使用条件

• 在拿取QSC微球的时候，试剂瓶从冰箱取出和放回去，应尽快，以减少温度变化带来的累积影响。
• 试剂瓶不能涡旋或是超声，可以用手摇匀增加单分散性。
• 在加入QSC微球前应准备好所有的其它试剂。
• 可以混合检测，也可以单组检测。一般说来，单组检测可以更好的圈门，所以最好。

与QSC kits抗体的相关信息

• 确认单抗来源是否适用于QSC试剂盒。该抗体来源是关键，而与目标细胞无关。例如，QSC抗小鼠IgG试剂盒就需要源自小鼠的抗体，而且该抗体需要具有与IgG结合的完整Fc区。如果抗体经过编辑，特别是Fc区经过任何改变，都有可以让结合力下降，从而导致信号弱。

• 荧光偶联抗体不能长时间用光照射，以防止光漂白，特别是蛋白荧光抗体（APC，PE）更是要注意。

• 确保激光器和探测器与报告荧光相匹配，也就是要选择正确的荧光通道。

• 我们已经知道一些抗体的Fc表现出与它们的对应二抗有不同的结合能力，并且在极少数情况下根本无法结合。如上面所说的，荧光一抗Fc端的变化，可能会导致结合变弱或是完全不结合。因此，如果有条件，我们必须对此进行测试。

• 某些时候，有的客户会用间接法荧光法来进行实验，也就是用一个对应的抗体与微球上的抗体结合后，再用一个带荧光的抗体来识别一抗。这往往会导致峰变宽，我们不推荐这样用，如果一定要用，可以单组检测。

• 不同克隆号，不同批次间的抗体，结合能力存在差异。换抗体前，如有条件，可用新旧抗体做一个平行对比实验，了解大致的趋势。

• QSC kits抗体的滴定

  • 定量检测中，让每个受体（微球上的抗体）都接上荧光报告抗体（荧光一抗），否则就会错过（低报），具体表现为峰会变宽，因此对抗体进行滴定非常重要。

  • 通常，使用制造商推荐的浓度作为起点，并选择一个较高/较低的稀释范围。然后用一个选一个最佳的浓度来孵育后续的微球 （注意空白微球不用染）。

  • 选最高密度那个球来做滴度确认，也就是4号球，如果4号球饱和了，向下也都能饱和。

  • 一般商业化的抗体推荐使用浓度都会大于饱和浓度；因此主要是向下稀释，也就是说比如厂家推荐1000X，为保险，可以用250X开始，向下稀释8个浓度；如果是自制的抗体，要自己估计初始浓度了。

  • 厂家建议是按2X稀释抗体，建立8个浓度，如果您不想消耗太多的QSC 微球，可以按4X稀释，减少3-4几个浓度， 当然你也可适当减少微球的体积，这需要自己计算其它试剂的加入量（提示的是：球少了，可能峰会宽一些，因取样少了，CV会大一点）。

  • 4号球的量肯定会被耗掉一些，但第一次找饱和滴度，这是没法避免的，如果换了新抗体，还必须重新摸浓度；好处是，细胞表面受体数量很少落在3-4号之间，所以就算没有4号，影响也不会很大，除非你的蛋白在细胞表面的表达量很高，才会在3-4之间，甚至在范围之外。

   

  因为是定量分析，任何因素的变动，都有可能导致检测结果产生较大的偏离。在保证正确选择和使用试剂的前提下，也必须强调仪器本身的校准也很重要。理想的是在相同/相近的条件下（甚至相同的检测人员）进行检测分析，让来自不同时间或不同实验室间的数据有可比性。